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Box-Behnken 设计-响应面法优化地龙活性组分的冻干工艺

时间:2017-12-03 点击次数:1177

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓 Pheretima
aspergillum (E. Perrier),习称“广地龙”[1],性味咸
寒,现代药理研究表明,地龙具有溶栓、抗肿瘤、
增强免疫力、降压镇静、改善微循环和心脑血管病
理状态、调节肝脏等作用,其主要活性成分是可溶
性蛋白质[2-6]。有研究发现可溶性蛋白是地龙溶血
栓、抗血栓的主要活性物质[7]。
目前,对从地龙中提取得到地龙蛋白的工艺研
究较多[8-9],但对已获得的活性蛋白后续处理工艺的
研究较少,因此本实验旨在能够zui大程度确保其活
性组分有效性的基础上,通过工艺处理后,较稳定
地保存已提取蛋白。本实验采用单因素试验结合
Box-Behnken 响应面法[10],以冻干率为指标,优化
地龙活性组分的冻干工艺,采用 HPLC 法,测定优
化后工艺样品的指纹图谱,并比较其与地龙药材指
纹图谱相似度,确定zui佳冻干工艺,为地龙同体制
剂的研制提供实验依据。
1 仪器与试剂
UV-2600 型紫外可见分光光度计,日本岛津公
司;电子分析天平,梅特勒-托利多(上海)仪器有
限公司;LYO-0.5(CIP)真空冷冻干燥机,上海东
富龙科技股份有限公司;SPX-250BZ 型生化培养
箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TD-WS
台式低速离心机,长沙湘鹰离心机有限公司;安捷
伦 1260 液相色谱仪系统,美国安捷伦公司;相似度
软件为“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”,中国
药典委员会。17 种氨基酸混合对照品(门冬氨酸、
谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨
酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、
异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)、
衍生试剂 A(异硫氰酸苯酯-乙腈溶液)和衍生试剂
B(三乙胺-乙腈溶液)均来自月旭公司氨基酸分析
包;尿激酶、凝血酶(牛血)、纤维蛋白原(牛血)
均购自中国食品药品检定研究院,批号分别为
140604-201224、140605-201125、140607- 201338;
琼脂糖,BR 级,批号 121129,上海如吉生物科技
发展有限公司;地龙对照药材,批号 120987-201107,
购自中国食品药品检定研究院;实验用水为娃哈哈
纯净水;其他试剂为分析纯。地龙药材购自亳州中
药材市场,产地广东佛山,批号 20131106,经湖北
省药学会中药鉴定分会陈科力教授鉴定为钜蚓科动
物参环毛蚓 Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干
燥体。
2 方法与结果
2.1 地龙药材提取物的制备
称取地龙粗粉 100 g,加水 500 mL,浸泡 60
min,超声处理(250 W,50 Hz)60 min,12 000 r/min
离心 10 min,得上清液。分别将 A、B 2 种衍生试
剂用乙腈稀释至原来浓度的 1/5,精密量取上清液 1
mL,置于试管中,加入稀释后的 A 溶液 0.5 mL 和
稀释后的 B 溶液 0.5 mL,涡旋混合 1 min,在 50 ℃
水浴中加热 45 min,取出,加入正己烷溶液 1 mL,
振摇,涡旋混合 1 min,静置 30 min,吸取下层澄
清液体,用孔径为 0.45 μm 有机滤膜滤过,即得到
衍生化后的样品溶液。
2.2 评价指标
2.2.1 冻干率[11] 冻干率是物料冻干后脱水质量
占物料水分总量的比例,本实验采用费休氏水分测
定法测定样品中的含水量从而计算出冻干率。
冻干率=1-含水量
2.2.2 指纹图谱相似度分析[12-13]
(1)对照品溶液的制备:取 Welch 公司 17 种
氨基酸混合对照品溶液(原浓度)用水稀释至原来
浓度的 1/10 作为对照品溶液。
(2)色谱条件:色谱柱为 Ultimate Amino Acid
AAA 氨基酸分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,月
旭材料科技有限公司);体积流量 1.0 mL/min;柱温
40 ℃;进样量 5 μL;检测波长 254 nm。流动相 A
为 0.1 mol/L 醋酸钠溶液(pH 6.5)-乙睛(93∶7);
流动相 B 为水-乙腈(20∶80),二元梯度洗脱,洗
脱程序:0~11 min,100%~93% A;11~13.9 min,
93%~88% A;13.9~14 min,88%~85% A;14~
29 min,85%~66% A;29~32 min,66%~30% A;
32~35 min,30%~0% A;35~45 min,0% A;45~
60 min,100% A。
(3)精密度试验:取“2.1”项下衍生化后供试
品溶液,按照上述色谱条件连续进样 6 次。将 6 次
测定图谱转化为 AIA 格式后依次导入相似度软件,
输出 17 个共有峰峰面积的 RSD 为 0.12%~3.43%,
保留时间的 RSD 为 0.04%~0.31%,表明仪器精密
度良好。
(4)稳定性试验:取“2.1”项下制备的同 1 份
衍生化后供试品溶液,在上述色谱条件下分别在 0、
2、4、6、8、12、24、48、72 h 进样,进行测定。
测定图谱转化为 AIA 格式后依次导入相似度软件,
输出 17 个共有峰峰面积的 RSD 为 0.17%~2.81%,
·3168· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
保留时间的 RSD 为 0.03%~0.13%,表明样品在 72
h 内稳定。
(5)重复性试验:取“2.1”项下平行制备的 6
份衍生化后供试品溶液,按照上述色谱条件进行测
定。测定图谱转化为 AIA 格式后依次导入相似度软
件,输出 17 个共有峰峰面积的 RSD 为 0.41%~
3.58%,保留时间的 RSD 为 0.03%~0.15%,表明方
法的重复性良好,证明分析方法和提取工艺的稳定
性和可靠性。
(6)共有图谱的建立:取“2.1”项下的衍生化
后供试品溶液,按照上述色谱条件连续进样 10 次,
取对照品溶液,按色谱条件项下条件进行测定并标
示,如图 1 所示,峰 1~17 为地龙氨基酸组分提取
物中含有的 17 种氨基酸成分,分别为门冬氨酸、谷
氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、
丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮
氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。其中
峰 10(胱氨酸)在 HPLC 图谱中分离良好,质量分
数较高且稳定,所以选择其为参照峰,共标示了 17
个共有峰。
1-门冬氨酸 2-谷氨酸 3-丝氨酸 4-甘氨酸 5-组氨酸 6-精氨酸 7-苏氨酸 8-丙氨酸 9-脯氨酸 10-胱氨酸 11-缬氨酸 12-蛋氨酸
13-异亮氨酸 14-亮氨酸 15-酪氨酸 16-苯丙氨酸 17-赖氨酸
1-aspartic acid 2-glutamic acid 3-serine 4-glycine 5-histidine 6-arginine 7-threonine 8-alanine 9-proline 10-cystine acid 11-valine
12-methionine 13-isoleucine 14-leucine 15-tyrosine 16-phenylalanine 17-lysine
图 1 地龙氨基酸组分提取物参照图谱
Fig. 1 Reference fingerprint of extract components of amino acid in lumbricus
2.3 冻干工艺单因素试验考察
2.3.1 共晶点(共融点)的测定及预冻温度的确定
溶液装入 10 mL 烧杯中,置于冻干机前箱,插入共
晶点探头及温度探头,启动共晶点测定仪,设定冻
干机预冻温度为−50 ℃,预冻 3 h,测定共晶点。
按照冻干理论[7],为保证物料完全冻结,产品预冻
温度一般应选择在共晶点温度以下 5~15 ℃为宜,
经测定该制品溶液的共晶点为−16.5 ℃,共融点为
−17.9 ℃,据此推测预冷冻温度应低于−26.5 ℃,
为确保产品在预冻时完全冻结,试验选择−26.5 ℃
为预冻温度。
2.3.2 预冻时间的确定 精密吸取地龙药液,在
−26.5 ℃下预冻,在−25 ℃进行升华干燥 16 h,40
℃进行解析干燥6 h,压力维持在15 Pa左右[14],
预冻时间分别设置为 2、3、4、5 h,以冻干产品外
观性状和冻干率为指标考察不同预冻时间对产品质
量的影响,结果见表 1。预冻时间仅 2 h 时,冻干产
品外观收缩,呈黄色团块,随着预冻时间的延长,
产品的性状良好,质地疏松,在预冻时间为 4~5 h
时,冻干品的外观及冻干率质量,因此确定预
冻时间为 4 h。
2.3.3 升华干燥温度对产品质量影响的单因素试验
1
2
3
4
5
8
6
7 9
10
11
12
13
14
15
16
17
0 5 10 15 20 25 30 35
t/min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3169·
表 1 预冻时间对产品质量的影响
Table 1 Effects of pre freezing time on product quality
预冻时间/h 性状 冻干率/%
2 收缩,黄色团块 50.00
3 略有鼓泡,淡黄色块状物,
质地疏松
93.46
4 淡黄色块状物,质地疏松 94.31
5 淡黄色块状物,质地疏松 94.33
升华干燥又称第 1 阶段干燥,是指冻结产品中的冰
晶升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥。当全部冰
晶除去时,第 1 阶段干燥完成,此时除去全部水分
的 90%左右。升华时所需热量由搁板供给,产品在
干燥时期温度必须低于其共融点的温度,同时考虑
到产能,因此在−26.5 ℃的温度下预冻 4 h,压
力维持在 15 Pa 左右,40 ℃进行解析干燥 6 h 的条
件下,选择升华干燥温度−18、−20、−22、−24 ℃ 4
个水平进行单因素试验,结果见表 2。升华阶段搁
板温度在低于共融点下,温度越高,产品的性状良
好,质地疏松,颜色均匀,产品冻干率提高;温度
越低,在同等升华干燥时间内,产品外观颜色深,
冻干率明显降低,可能是产品干燥不充分,需要延
长升华干燥时间,但是从能耗角度,已经不具备可
行性,因此确定升华干燥温度−18、−20、−22 ℃作
为 Box-Behnken 设计实验的 3 个水平。
表 2 升华干燥温度对产品质量的影响
Table 2 Effects of sublimation drying temperature on
product quality
搁板温度/℃ 性状 冻干率/%
−18 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 92.60
−20 质地疏松,淡黄色块状,颜色较均匀 96.01
−22 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 94.18
−24 质地疏松,淡黄色块状,中间颜色深 88.75
2.3.4 升化时间对产品质量影响的单因素试验 在
升华干燥阶段,升华时间是很关键的因素,时间太
短,搁板温度很快达到预定的温度,使供给物料的
热量也增加的过快,导致超过物料的共融点温度使
其融化。因此在确定−26.5 ℃的温度下预冻 4 h,40
℃进行解析干燥 6 h,暂定升华温度为−20 ℃不变
的条件下,选择以下 4 个时间段位因素进行考察,
结果见表 3。进入升华干燥阶段,升华时间过短会
导致冰晶融化,冻干率很低,随着升温时间的延长,
产品性状良好,时间过长会加长冻干周期且消耗不
表 3 升华时间对产品质量的影响
Table 3 Effects of sublimation time on product quality
升华时间/h 性状 冻干率/%
5 收缩,颜色不均匀 33.00
6 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 94.18
7 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 96.01
8 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.60
必要的能量,因此确定升华时间 6、7、8 h 作为
Box-Behnken 设计实验的 3 个水平。
2.3.5 解析干燥温度对产品质量影响的单因素试验
为了使产品达到合格的残余含水量,必须对产品进
一步干燥,产品的热量主要靠搁板供给,所以在
−26.5 ℃的温度下预冻 4 h,−20 ℃进行升华干燥 7
h 不变的条件下,选择 20、25、30、35 ℃ 4 个温
度进行单因素试验,结果见表 4。在解析干燥阶段,
随着温度的上升,冻干效果显著,当搁板温度为 30
℃时,冻干产品性状良好,骨架结构完整,海绵状,
颜色均匀,冻干效果已经较好,随着搁板温度继续
增高,冻干率也不能增加,且增加产能,因此确定
解析温度 20、25、30 ℃作为 Box-Behnken 设计实
验的 3 个水平。
表 4 解析干燥温度对产品质量的影响
Table 4 Effects of analytical drying temperature on
product quality
搁板温度/℃ 性状 冻干率/%
20 质地疏松,黄色块状物,中间颜色
稍深
93.08
25 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 94.25
30 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.51
35 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.48
2.3.6 解析干燥时间对产品质量影响的单因素试验
解析干燥时间同样是影响冻干工艺样品的参数之
一,因此在−26.5 ℃的温度下预冻 4 h,−20 ℃进行
升华干燥 7 h,解析干燥温度暂定为 30 ℃不变的条
件下,选择以下 4 个时间进行试验,结果见表 5。
在解析干燥阶段,随着解析干燥时间的延长,冻干
效果显著,冻干周期也延长,能耗越来越高,至解
析干燥 4 h 后,再延长时间,已基本无影响,因此
确定解析干燥时间 3.0、3.5、4.0 h 作为 Box-Behnken
设计实验的水平。
2.4 响应面优化试验
2.4.1 试验设计及结果 通过预试验和单因素试验
·3170· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
表 5 解析干燥时间对产品质量的影响
Table 5 Effects of analytical drying time on product quality
解析时间/h 性状 冻干率/%
3.0 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.06
3.5 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.25
4.0 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 96.01
4.5 质地疏松,淡黄色块状,颜色均匀 95.94
的考察,仅确定部分参数,其zui佳工艺需进一步优
选,本实验选取升华干燥温度(A)、升华时间(B)、
解析干燥温度(C)、解析干燥时间(D)为考察因
素,以冻干率为评价指标,采用 Box-Behnken 响应
面法对工艺进行优化,考察各因素对产品质量的综
合影响,试验设计及结果见表 6。方差分析见表 7。
2.4.2 回归模型的建立及方差分析 采用 Design
表 6 地龙活性组分冻干工艺响应面优化试验设计及结果
Table 6 Design and experimental results of process of freeze-dried optimization of active components in lumbricus
试验号
因素 冻干率/%
试验号
因素 冻干率/%
A/℃ B/h C/℃ D/h 实测 预测 A/℃ B/h C/℃ D/h 实测 预测
1 −18 (1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 94.06 94.44 15 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 3.0 (−1) 91.28 91.67
2 −18 (1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 93.90 93.63 16 −20 (0) 6 (−1) 35 (1) 3.5 (0) 94.66 94.36
3 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 4.0 (1) 93.82 94.21 17 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.57 96.62
4 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.50 96.62 18 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.79 96.62
5 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 4.0 (1) 94.45 94.81 19 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 3.0 (−1) 90.58 91.01
6 −22 (−1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 94.79 94.67 20 −22 (−1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 94.76 95.16
7 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 89.92 89.64 21 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 3.0 (−1) 90.66 90.37
8 −18 (1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 94.52 94.26 22 −22 (−1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 95.42 95.30
9 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 4.0 (1) 93.96 93.86 23 −18 (1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 91.12 91.82
10 −20 (0) 6 (−1) 25 (−1) 3.5 (0) 94.82 94.69 24 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 3.0 (−1) 90.82 90.69
11 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.96 93.84 25 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.07 92.80
12 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 4.0 (1) 93.79 93.54 26 −20 (0) 8 (1) 35 (1) 3.5 (0) 95.27 95.00
13 −20 (0) 8 (1) 25 (−1) 3.5 (0) 95.41 95.31 27 −22 (−1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 93.10 93.18
14 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 90.79 90.67
表 7 方差分析
Table 7 ANOVA regression analysis
方差来源 平方和 自由度 F 值 P 值 显著性 方差来源 平方和 自由度 F 值 P 值 显著性
A 3.23 1 17.71 0.001 2 ** A2 14.92 1 81.70 <0.000 1 **
B 1.19 1 6.52 0.025 3 * B2 1.25 1 6.84 0.022 6 *
C 0.30 1 1.66 0.221 3 C2 8.94 1 48.98 <0.000 1 **
D 30.08 1 164.75 <0.000 1 ** D2 55.00 1 301.20 <0.000 1 **
AB 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 残差 2.19 12
AC 5.29 1 28.97 0.000 2 ** 失拟项 2.15 10 9.37 0.100 2
AD 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 纯误差 0.046 2
BC 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 总和 103.27 26
BD 1.23×10−3 1 6.71×10−3 0.936 1 变异系数 0.004 6
CD 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 校正决定系数 0.978 8
*
P<0.05,模型或考察因素有显著影响;**P<0.01,模型或考察因素有极显著影响
*
P < 0.05, model or investigation factor with significant effect; **P < 0.01, model or investigation factor with extremely significant effect
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3171·
Expert 8.05 软件,分别对各因素水平进行多元线性
回归和非线性回归(二项式拟合),建立地龙活性组
分冻干率(Y)对 4 个因素(A、B、C、D)的 2 次
回归模型方程为 Y=96.62-0.52 A+0.32 B-0.16
C+1.58 D-0.002 5 AB-1.15 AC-0.005 AD+
0.005 BC-0.017 BD-0.002 5 CD-1.67 A2-0.48
B2
-1.29 C2
-3.21 D2

经方差分析(表 7)得知,自变量 1 次项 B,2
次项 B2显著(P<0.05),1 次项 A、D,2 次项 AC、
A2
、C2
、D2极显著(P<0.01),表明模型具有统计
学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程
度,即二者差异的程度,本例 P 值为 0.100 2>0.05,
对模型是有利的,无失拟因素存在。进一步,校正
决定系数(0.978 8>0.80)和变异系数为 0.46%,
说明该模型只有 2.12%的变异,表明该模型拟合优
度较好,可用该模型及回归方程代替试验真实点对
实验结果进行分析和预测(预测结果见表 6)。
2.4.3 反应条件的优化及模型验证 各因素之间的
响应面图和等高线图见图 2,由 Design Expert 8.05
软件分析得响应面值zui大时,A、B、C、D 对应的
编码值分别为 0、0、0、0,与之对应的地龙活性组
分zui佳冻干工艺条件为升华干燥温度−20 ℃、升华
图 2 Y 与 4 因素的三维效应面图和等高线图
Fig. 2 3D Response surface plots and contour plots of Y and four factors
97
Y/%
B/h A/℃
B/h
A/℃ A/℃
Y/%
Y/%
Y/% Y/%
Y/%
Y/%
B/h C/℃
C/℃ D/h
C/℃ D/h D/h
−21 A/℃ −19
6.5 B/h 7.5 27 C/℃ 33
B/h
C/

D/h
C/

D/h
D/h
95
93
7.5
6.5
−19
−21
97
94
91
33
27
−19
−21
90
94
98
3.2
3.8
−21
−19
97
96
95
94
33
27
7.5
6.5
97
94
91
3.2
3.8
6.5
7.5
91
94
97
3.8
3.2
33
27
7.5
6.5 27
33
3.2
3.8
−21 A/℃ −19 −21 A/℃ −19
Y/% Y/%
27
33
3.2
3.8 3.8
3.2
6.5 B/h 7.5
Y/% Y/% Y/%
·3172· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
时间 7 h、解析干燥温度 30 ℃、解析干燥时间 3.5 h,
此时冻干率的理论值达 96.62%。
2.5 验证试验
为检验单因素及响应面预测的可靠性,选择zui
佳冻干工艺条件(预冻温度−26.5 ℃,预冻 4 h,升
华干燥温度−20 ℃、升华时间 7 h、解析干燥温度
30 ℃、解析干燥时间 3.5 h)进行 3 批放大工艺验
证试验,测定冻干率,并为确认本工艺不影响地龙
氨基酸组分的活性,将验证批样品与对照药材的氨
基酸指纹图谱进行相似性分析,判断是否zui大程度
保留其活性组分的有效性[2-3]。
结 果 3 批样品的冻干率分别为 96.59% 、
96.45%、96.61%,指纹图谱相似度分别为 0.912、
0.905、0.915。采用zui佳冻干工艺条件得到的地龙
提取物颜色均匀,性状良好,测得冻干率在 96.55%,
与预测值 96.62%基本吻合,说明响应面法优化的冻
干工艺条件稳定,与对照药材的氨基酸指纹图谱相
似度均大于 0.9,表明该工艺具备可行性。
3 讨论
动物药活性成分以多肽和蛋白质为主,地龙中
含量zui为丰富的物质即为蛋白质,但其主要成分氨
基酸类具有水溶性和对热不稳定的性质,因此对提
取后活性成分处理和保存是非常关键的。本实验采
用冷冻干燥技术,应用单因素及 Box-Behnken 响应
面设计方法,对其活性组分冻干工艺进行优化。结
果表明,此优化方法在保证获得较好冻干率的基础
上,能够zui大程度地保留地龙提取物有效成分的活
性,工艺稳定可行,为地龙制剂研究及临床应用提
供一定的实验基础。
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