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NV蛋白酶冻干工艺的相关技术参数

时间:2017-12-03 点击次数:1264

(Perinereisnuntia) 和 双 齿 围 沙 蚕 (Perinereis
aibuhitensis)等,北 方 (辽 宁、山 东 和 河 北) 以
日本刺沙蚕居多,南方 (江苏、福建和浙江)以双
齿围沙蚕为主。NV 蛋白酶 (曾用名:溶栓素)是
一种本课题组首先分离纯化的 丝 氨 酸 蛋 白 水 解
酶[1],该酶已在Swissprot蛋白库中著录 (著录号
为 P83433), 申 请 了 我 国 专 利 (申 请 号 为
02144828.0) 并 获 得 专 利 公 开 (公 开 号 为
1500873)。本文作者在完成 NV 蛋白酶纯化工艺和
质量标准的基础上[2-4],进一步获得 NV 蛋白 酶 药
理学研究数据[5-6]。本研究旨在为 NV 蛋白 酶 的 冻
干工艺确定相关技术参数。
1 材料与方法
1.1 主 要 试 剂 Sephadex G-15 购 自 美 国
Pharmacia公司,PierceTM BCA ProteinAssayKit
购自 美 国 ThermoFisherScientific公司,偶 氮 酪
蛋白、d-10樟脑磺酸、六次甲基四胺和 Tween80
均购自美国Sigma-Aldrich公司,其他药品购自北
京化学试剂公司。
1.2 NV 蛋白酶的活性测 定 在0.01 mol·L-1
Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.3) 缓 冲 条 件 下 制 备
NV 蛋白酶溶液,分别检测4℃~45℃时 NV 蛋白
酶的活性。分别使用0.01mol·L-1的不同pH 缓
冲液 (表 1),预洗 脱 SephadexG-15 色谱 柱,冻
干 制 备 的 NV 蛋 白 酶 上 样 洗 脱, 分 别 制 备 在
0.01mol·L-1上述缓冲体系下的 NV 蛋白 酶 溶 液
并检测其活性。
表1 NV 蛋白酶的缓冲体系
Tab.1 BuffersystemforNVprotease
pH Buffer   
1.0 KCl-HCl
2.0 Citricacid-Na2HPO4
3.0 Citricacid-Na2HPO4
4.0 Citricacid-Na2HPO4
5.0 Citricacid-Na2HPO4
6.0 Citricacid-Na2HPO4
7.0 Citricacid-Na2HPO4
8.0 Citricacid-Na2HPO4
9.0 Glycine-NaOH
10.0 Glycine-NaOH
NV 蛋白酶活性检测采用偶氮酪蛋白方法:经
卡马斯亮 蓝 G-250染料 结 合 法 定 量 后,配 成 浓 度
为0.2g·L-1的 NV 蛋白酶溶液。50μLNV 蛋白
酶溶液与500μL0.5% 偶氮 酪 蛋 白 溶 液 混 合,在
37℃ 条件下保温10min。加入10% 三氯乙酸溶液
1mL,以 Parafilm 薄膜 封 住 管 口,于 振 荡 器 上 振
荡。10000r·min-1离心2min,将上清液移入比
色皿,以上述相应pH 值的缓冲液为空白对照,在
440nm 处测定 吸 光 度 (A)值。活 性 检 测 分 别 重
复3次。
1.3 NV 蛋白酶的二级结构检测 采用62ADS型
圆二色 谱 仪 (美 国 AVIV 公司)表 征 NV 蛋白 酶
的二级结构。采用1g·L-1d-10樟脑磺酸水溶液,
以1mm 的吸收池校正仪器。试剂用水为经石英双
蒸馏水器蒸馏的新双蒸馏水,所有试剂皆为现用现
配,并用高纯度氮气饱和。NV 蛋白酶远紫外圆二
色谱测定选用光程为 1 mm 的 吸 收 池,在 200~
250nm 间扫 描。测 试 前 充 分 恒 温 (2h),每个 测
试结果均为3次单独测定的平均结果。蛋白质二级
结构的计算采用奇异值分解zui小二乘法计算,结构
数据微分分析采用 Origin6.0软件,双变量相关性
分析采用SPSS10.0数据分析软件。
1.4 NV 蛋 白 酶 的 冻 干 过 程 0.01 mol·L-1
Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.3)缓冲条件下制备的
NV 蛋白酶溶液装入5mL 西林瓶,将西林瓶置于
冻 干 托 盘, 放 置 到 预 先 灭 菌 处 理 的 VirTis
Advantage冻干机中。启动真空泵,将冷冻仓真空
度降为200Torr。启动搁板制冷,-40℃预冻4h。
将 搁 板 温 度 升 至 -10℃, 第 一 阶 段 干 燥 时 间
13.5h。将搁板温度升至0℃,第二阶段干燥时间
8h,至冷冻仓真空度 为250Torr,终止 冻 干。启
动压盖程序,将西林瓶封严。
1.5 NV 蛋白酶冻干品复溶后浊度测定 吸取 硫
酸肼 溶 液 5 mL 与 六 次 甲 基 四 胺 溶 液 5 mL 于
100mL容 量 瓶 中 混 匀。25℃ ±3℃ 下 静 置 反 应
24h。冷后用 水 稀 释 至 标 线,混 匀。此 溶 液 浊 度
(单位:NTU)为400NTU。吸取 浊 度 标 准 液0、
0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 和 12.50 mL,
置于比色管中,加水至标线。摇匀后,即得浊度为
0.4、10.0、20.0、40.0 及 80.0 NTU 的 标 准 系
列。于680nm 波长 测 定 浊 度 标 准 液 吸 光 度 (A)
值,计算标准曲线回归方程。吸取 NV 蛋白酶冻干
品生理盐水 复 溶 液 于 比 色 管 中 测 定 A 值,由 标 准
曲线回归方程计算样品浊度。
1.6 不同浓 度 Tween80条件 下 NV 蛋白 酶 冻 干
品的复溶 对 NV 蛋白酶样品分别添加0.015%、
0.010% 和 0.015% 的 Tween 80, 采 用 2.0、
812 吉林大学学报 (医学版) 第43卷 第1期 2017年1月
2.5和3.0 ℃·min-1冷冻 速 率 冻 干,其 余 冻 干 技
术参数见1.4。
2 结 果
2.1 不同温度下 NV 蛋白酶二级结构和活性 在
4℃~45℃ 范围内,NV 蛋白酶α-螺旋结构比率和
活性随温度升高呈下降趋势,β-折叠结构比率变化
不明 显。NV 蛋 白酶活性与温度呈正相关关系
(r=0.753,P<0.01)。α-螺旋 结 构 比 率 与 温 度 和
活性均 呈 负 相 关 关 系 (r= -0.968,P<0.01)。
NV 蛋白酶β-折叠结构比率与温度和活性均无相关
关系 (P>0.05) (图1)。经奇异值分解zui小二乘
法计算 和 结 构 数 据 微 分 分 析,α-螺旋 结 构 是 维 持
NV 蛋白 酶 在 不 同 温 度 条 件 下 的 主 要 结 构 构 象,
2种结构变化的相变点为36.8℃。
图1 不同温度下 NV 蛋白酶二级结构和活性
Fig.1 SecondarystructuresandactivitiesofNVprotease
atdifferenttemperatures
2.2 不同pH 值时 NV 蛋白酶 二 级 结 构 和 活 性
在pH 值1~10范围内,NV 蛋白酶活性与 pH 值
呈正相关关系 (r=0.924,P<0.01)。NV 蛋白酶
α-螺旋结 构 比 率 和 β-折 叠 结 构 比 率 呈 波 动 变 化;
α-螺 旋结 构 比 率 与 pH 值 无 相 关 性 (P>0.05),
而与活性呈正相关关系 (r=0.721,P<0.01);
NV 蛋白酶β-折叠结构比率与pH 值和活性均无相
关性 (P>0.05)。见图2。
2.3 NV 蛋白酶的冻干过程 在预冻阶段内温 度
下降曲线与隔板温度下降曲线基本保持一致,只是
其 斜 率 略 低。 在 第 一 干 燥 阶 段, 样 品 温 度
(Curve1)随隔板升温而升温,隔板温度(Curve2)
达到预定温度后基本维持不变,而样品温度波动较
大,10.5h后样 品 温 度 波 动 幅 度 逐 渐 缩 小。在 第
二干燥阶段,样品温度随隔板上升斜率较*干燥
阶段有所提高,隔板温度达到预定温度后基本维持
不变,而样 品 温 度 有 小 幅 波 动,22h后样 品 温 度
逐渐接近隔板温度。在*和第二干燥阶段,冷凝
器温 度 (Curve3)基 本 维 持 在 -45℃ ~ -40℃,
冷凝器在第二干燥阶段温度波动比*干燥阶段明
显减少。在 预 冻 阶 段 内,冻 干 仓 压 力 (Curve4)
下降 迅 速。在 第 一 干 燥 阶 段 的 初 始 阶 段 (4.0~
7.5h),冻干仓压力随隔板升温而提高;在中间阶
段(7.5~12.0h),冻干仓压力波动较大,与 样 品
温度波 动 有 一 定 的 一 致 性;在 结 尾 阶 段 (12.0~
13.5h),冻干仓压力波动渐趋平静。在 第 二 干 燥
阶段,冻干仓压力在小幅上升后,逐渐下降,与样
品温度变化趋势相反。见图3。
图2 不同pH 值时 NV 蛋白酶二级结构与活性
Fig.2 SecondarystructuresandactivitiesofNVprotease
atdifferentpHvalues
Curve 1:Sample temperature;Curve 2:Heater temperature;
Curve3:Cooler temperature;Curve 4:Lyophilization chamber
pressure.
图3 NV 蛋白酶的冻干曲线
Fig.3 LyophilizationcurvesofNVprotease
2.4NV 蛋白酶不同平均冷冻速率时冻干品复溶后
浊度和活性 NV 蛋白酶冻干品复溶后浊度随平均
冷冻速率的上升而明显上升,NV 蛋白酶冻干品复
溶后活性随平均冷冻速率的上升而缓慢下降。
见图4。
张连芝,等 . NV 蛋白酶冻干工艺的相关技术参数 813
2.5 不同浓 度 Tween80条件 下 NV 蛋白 酶 冻 干
品复溶活性和浊度 添加0.005% Tween80后各
冷冻速率组 (2.0、2.5和3.0 ℃·min-1)NV 蛋
白酶活 性 明 显 增 加 (图 5)。添加 0.015% Tween
80后各冷 冻 速 率 组 (2.0、2.5和3.0℃·min-1)
NV 蛋白酶浊度明显降低。见图6。
图4 不同平均冷冻速率时 NV 蛋白酶浊度和活性
Fig.4 Turbidities and activities of NV protease with
differentaveragefreezingrates
图5 添加不同浓度 Tween80后 NV 蛋白酶的活性
Fig.5 Activitiesof NV proteaseafteradding different
concentrationsofTween80
图6 添加不同浓度 Tween80后 NV 蛋白酶的浊度
Fig.6 Turbiditiesof NV proteaseafteraddingdifferent
concentrationsofTween80
3 讨 论
干燥过程是药品生产环节中成本zui高的,而蛋
白药物的冻干又是所有药品干燥过程中zui为昂贵
的。蛋白药物的冻干过程伴随着蛋白变性,复溶后
蛋白药物能否保证充分的溶解度和活性是冻干工艺
研究的关键。
蛋白质二级结构是确定蛋白药物的冻干工艺的
重要数据,冻干过程中势必出现由温度的降低导致
的蛋白质二级结构变化[7-8]。蛋白的 缓 冲 溶 液 组 成
成分的温度-溶解 度 曲 线 差 别 较 大,冻 干 过 程 中 同
样产生 由 pH 的改变导致的蛋白质二级结构变
化[9]。由于 NV 蛋白酶纯化和保存缓冲体系是pH
值为 7.3 的 Na2HPO4-NaH2PO4,Na2HPO4 的溶
解度随温度下降而降低,NV 蛋白酶在冻干的初始
阶段势必会经过温度和pH 值降低的双重过程。蛋
白结构是维持其活性的关键,本实验根据现有的仪
器条件首先研究了温度、pH 值对 NV 蛋白酶二级
结构和活性的影响。本研究结果显示:α-螺旋结构
是维持 NV 蛋白酶在不同温度条件下的主要结构构
象,在低温条件下所维持的结构比率高于其在高温
条件下所 维 持 的 结 构 比 率,而 且 α-螺旋 结 构 比 率
变化与pH 值变化不相关。因此,NV 蛋白酶具有
一定的抵抗冻干过程中温度和pH 值降低的能力。
平均冷冻速率是降低冻干药品生产时间成本的
关键[10]。本研 究 结 果 显 示:NV 蛋白酶冻干品复
溶后浊度随平均冷冻速率的上升而明显上升,表明
NV 蛋白酶在冻干过程中存在蛋白表面变性。蛋白
表面变性是蛋白冷冻变性的重要组成;与急速冷冻
相比,慢速冷冻所形成的冰-液界面相对面积较小,
因此慢速冷冻的蛋白产品比急速冷冻产品的浊度明
显降低[11-12]。此外,本文作者还发现:NV 蛋白酶
冻干品复溶后活性随平均冷冻速率的上升而缓步下
降,该结 果 与 Sarciaux等[12]和 Strambini等[13]研
究结果一致。Strambini等[13]研究发现:冷冻过程
伴随蛋白质天然折叠的解开和二级、三级结构的破
坏,但这 一 过 程 是 部 分 可 逆 的。 本 文 作 者 研 究
Tween80 作 为 冻 干 变 性 防 护 剂 的 可 能 性 发 现:
Tween80能够明显提高 NV 蛋白酶复溶活性和溶
解度,0.01% Tween80可以作为平衡 NV 蛋白酶
复溶 活 性 和 溶 解 度 的 权 宜 浓 度;平 均 冷 冻 速 率
2.0℃·min-1可以作为降低冻干药品生产时间成
本 的 权 宜 冷 冻 速 率 参 数。 本 研 究 结 果 可 以 与
Chang等[11]研究结果相互印证。
Tween80是非离子型表面活性剂。研究[14]发
现:离子型表面活性剂容易使蛋白变性,而非离子
型表面活性剂通常不导致蛋白 变 性。Tween20和
Tween80是蛋白制剂中广为使用的表面活性稳定
814 吉林大学学报 (医学版) 第43卷 第1期 2017年1月
剂,过氧化物是 Tween20和 Tween80的主 要 污
染 物[15]。Knepp 等[16] 研 究 发 现:Tween20 和
Tween80 的过 氧 化 物 可 以 导 致 蛋 白 的 氧 化 降 解。
因此,目前 Tween80作为 NV 蛋白酶冻干变性防
护剂的研 究 尚 缺 少 Tween80 的 过 氧 化 物 含 量 和
NV 蛋白酶降解的检测。此 外,由 于 Tween80对
蛋 白 的 圆 二 色 谱 干 扰 较 大, 未 能 获 得 添 加
Tween80 的 NV 蛋白酶圆二色谱数据。
综上所述,NV 蛋白酶具有一定的抵抗冻干过
程中温度和pH 降低的能力,NV 蛋白酶复溶活性
和 溶 解 度 受 平 均 冷 冻 速 率 的 影 响。0.01%
Tween80 和2.0℃·min-1平均冷冻速率是 NV 蛋
白酶生产性冻干的有效技术选择。
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