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丙氨酰谷氨酰胺溶液预冻方式对冻干样品结晶度的影响

时间:2017-12-03 点击次数:1356

丙氨酰谷氨酰胺( alanylglutamine,Ala-Gln) 作
为谷氨酰胺的替代药物,是一种静脉营养注射
剂,其对烧伤、大手术和急慢性感染等严重代谢
疾病[1]、肠炎和放化疗所致黏膜损害引起的肠道
功能不全、艾滋病和白血病等导致的免疫缺乏综
合征等疾病具有良好的治疗效果,并且对处于生
命危急时刻的病人及时补充该药物,可显著缩短
病人住院治疗和痊愈恢复的时间[2-4]。由于真空
冷冻干燥技术是高真空度零度以下,使样品中的
水分由冰直接升华干燥的,因此能较好地维持热
敏药物的活性结构,保存热敏药物的活性成分,
保持其生物活性和疗效。另外,经真空冻干的药
品一般晶粒较小,溶解性较好。因此,为了提高
丙氨酰谷氨酰胺药品的冻干效率,并保持其良好
的复溶性,通常利用真空冷冻干燥技术将药品制
备成固体粉针剂保存[5-6]。
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冷冻干燥过程主要分为预冻、升华干燥和解析
干燥3 个步骤。在预冻方式上,丙氨酰谷氨酰胺此
前主要采用快冻降温预冻方式。但快冻降温预冻会
导致丙氨酰谷氨酰胺药物形成玻璃态或晶体结晶度
不佳,容易包夹水分,即没有实现真正意义上的zui大
冻结浓缩状态。在升华干燥时,传热传质通道不畅,
水汽的流动阻力大,干燥效率低。同时,玻璃态药品
和晶体缺陷较多的微晶中包夹的水分在解析干燥
时,也难以解吸。由此,导致整个干燥过程,干燥时
间长,干燥效率低。
为解决以上问题,我们对预冻环节采用多次变
温退火预冻。并通过扫描电镜、X-射线粉末衍射、差
示扫描量热仪和热重分析等实验手段系统研究和比
较以上两种不同预冻方式对丙氨酰谷氨酰胺溶液结
晶度和粒度的具体影响,为冻干工艺的改进优化提
供实验依据。
1 材料与仪器
实验中所用丙氨酰谷氨酰胺重结晶标准样品来
自海南灵康药业集团有限公司。冻干前,配置30%
的丙氨酰谷氨酰胺溶液待用。实验用水为去离
子水。
LYO - 0. 2 实验用冻干机( 上海东富龙科技股
份有限公司) ,DSC1 差示扫描量热仪( 瑞士Mettler-
Toledo 公司) ,TGA/DSC1 热重分析仪( 瑞士Mettler-
Toledo 公司) ,Bruker D8 Advance X 射线粉末衍射仪
( 德国布鲁克公司) 。
2 方法
2. 1 冻干工艺
LYO-0. 2 冻干机,降温速率均为1. 5 ℃ ·
min - 1,升温速率均为0. 5 ℃·min - 1。丙氨酰谷氨
酰胺样品快速冻干时,预冻温度为- 45 ℃,维持5
h; 升华干燥的温度为- 35 ℃,维持13 h; 解析干燥
的温度为30 ℃维持3 h。其退火冻干的预冻温度为
- 40 ℃,维持1 h; 退火至- 6 ℃维持30 min,降至-
40 ℃维持5 h; 解析干燥的温度为- 5 ℃,维持13 h;
解析干燥的温度为30 ℃,维持3 h。
2. 2 扫描电镜( SEM) 的测定
扫描电镜为FEI Quanta 450 场发射扫描电镜,
样品测定前预先进行喷金处理20 s。
2. 3 X-射线粉末衍射( XRD) 的测定
X-射线源为Cu 靶,陶瓷光管,步长为0. 02°,扫
描速度为4 °·min - 1,2
θ 角测试范围为10 ~ 80 °。
2. 4 差示扫描量热( DSC) 的测定
温度和热熔标定采用标样铟( In) 和标样锌
( Zn) 升温过程中的单质铟和单质锌的熔融( 均采用
外推起始温度) 进行两点标定。标定速率为10
℃·min - 1,液氮冷却采用Cryofab 公司的液氮容器
控制。样品冲洗气体为高纯度氮气( 纯度>
99. 999%) ,流量20 mL·min - 1 保持不变。样品量
为5 ~ 10 mg,采用瑞士Mettler-Toledo 公司的XS205
电子天平称量,度± 0. 01 mg。
样品皿为40 μL 标准液体铝皿,用液固通用压
机压制。本实验的测量温度范围为25 ~ 250 ℃。设
定的实验程序为以30 ℃·min - 1 的速率从25 ℃升
温至60 ℃,60 ℃恒温10 min,再以10 ℃·min - 1 的
降温速率降温至25 ℃,zui终以5 ℃·min - 1 的升温
速率,从25 ℃升温至250 ℃进行数据采集。
分解温度取吸热峰的峰值温度,熔融焓以熔融
峰的峰面积计。
2. 5 热重分析( TGA) 的测定
样品用量为5 ~ 15 mg。样品皿为铂坩埚。加
热温度范围为50 ~ 800 ℃,升温速率为10
℃·min - 1。选用气氛为动态氮气,气体流速为2
0 mL·min - 1。
3 结果与讨论
3. 1 从扫描电镜结果分析预冻方式对丙氨酰谷氨
酰胺结晶度的影响
为研究预冻方式对丙氨酰谷氨酰胺冻干样品形
态的影响,我们分析了快速降温预冻和多次变温退
火预冻再冻干所得样品的扫描电镜图( 图1) 。同时
选择丙氨酰谷氨酰胺标准样品即原料药( 图1A) 进
行对比分析。
图1B 为快速降温预冻冻干的丙氨酰谷氨酰胺
冻干样品的扫描电镜图,发现快速降温预冻再冻干
的样品,晶体较丙氨酰谷氨酰胺标准样品更细碎,颗
粒小,大颗粒的样品较少,其原因是由于降温速率较
快,导致短时间内药物分子的晶核形成较多,而晶体
生长时间较短,zui终丙氨酰谷氨酰胺分子形成了数
目众多而体积细小的微晶[5],甚至有玻璃态药物存
在。所以丙氨酰谷氨酰胺冻干样品粒度细小,结晶
度较低。图1C 为多次变温退火预冻再冻干的丙氨
酰谷氨酰胺冻干样品的扫描电镜图,发现样品经多
次变温退火预冻处理再冻干,样品晶体粒度稍大。
溶液中的药物经过二次浓缩和重结晶,粒度大、晶形
和大小分布均匀。由于经过多次变温退火预冻处理
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后,晶体缺陷少,可以推测冻干样品结晶程度要好。
3. 2 从X-射线衍射结果分析预冻方式对丙氨酰谷
氨酰胺结晶度的影响
为研究预冻方式对丙氨酰谷氨酰胺样品结晶度
的影响,我们分别分析了快速降温预冻和多次变温
退火预冻后再冻干所得样品的X-射线粉末衍射图
谱。各样品的相对结晶度通过衍射峰面积和衍射图
谱总面积的比较获得。选择丙氨酰谷氨酰胺标准样
品为参照样。
丙氨酰谷氨酰胺标准样品、快速降温预冻冻
干样品和多次变温退火预冻冻干样品XRD 图谱曲
线中各主要衍射峰的位置完全重合,这说明3 种
丙氨酰谷氨酰胺样品的晶型和成分也完全一致
( 图2) 。但是各丙氨酰谷氨酰胺样品的结晶度却
相差较大。
丙氨酰谷氨酰胺标准样品XRD 图谱曲线中各
主要衍射峰峰形尖锐,曲线光滑,各峰区分明显,重
叠度极小。特别是*主峰达4 500 counts。标准
样品的相对结晶度为69. 03%。这说明该丙氨酰谷
氨酰胺样品结晶度相对完好。
快速降温预冻再冻干的丙氨酰谷氨酰胺样品
XRD 图谱曲线中各主要衍射峰的位置尽管和参考
图谱中的峰位置一致。但是*主峰仅1 500
counts,各峰高相对参照样品的对应衍射峰峰高也明
显降低,约是标准样品的对应衍射峰峰高的33%。
该样品的相对结晶度为36. 47%。这些结果说明,
这种方式冻干的丙氨酰谷氨酰胺样品结晶度明显降
低,晶体缺陷增加,无定形成分多。一般来讲,结晶
度低、晶体缺陷多的样品,容易包夹水分,水分升
华难。
先退火预冻再冻干的丙氨酰谷氨酰胺样品
XRD 图谱曲线与丙氨酰谷氨酰胺标准样品的XRD
参照图谱的各主要衍射峰位置也完全一致。*主
峰为3 500 counts,各峰高相对标准样品对应衍射峰
也有降低,约是标准样品的对应衍射峰峰高的
78%。但是却比快速降温预冻再冻干的丙氨酰谷氨
酰胺样品对应XRD 衍射峰要高得多。相对结晶度
为50. 18% 。这些实验结果说明,多次变温退火预
图1 丙氨酰谷氨酰胺扫描电镜图( × 10 000)
A - 标准样品; B - 快速降温预冻冻干样品; C - 多次变温退火预冻冻干样品
Fig. 1 SEM Pictures of alanylglutamine samples( × 10 000)
A - standard sample; B - freeze-dried sample following accelerated pre-freeze; C - freeze-dried sample following multi-step annealing pre-freeze
图2 丙氨酰谷氨酰胺的XRD 图谱
Fig. 2 XRD Spectrums of alanylglutamine samples
冻再冻干的丙氨酰谷氨酰胺样品结晶度虽然没有标
准样品好,但显然比快速降温预冻冻干的样品结晶
好得多,颗粒大,晶体缺陷少。显然多次变温退火预
冻再冻干的样品纯度高,质量更优,水分升华速度
快,干燥效率高。
由此可见,通过改变预冻方式提高丙氨酰谷氨
酰胺溶液中样品的结晶度和粒度,可以减小冻干过
程中水分的升华阻力,提高传热传质效率,zui终可以
提高干燥效率。可以推断,改变预冻方式后,丙氨酰
谷氨酰胺结晶度和粒度提高,水结晶度也提高,能量
代谢好,冻干效率高。在相同冻干条件下,冻干机承
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载的丙氨酰谷氨酰胺药品浓度和体积可以大大增
加,产量也会得到提升。可见,丙氨酰谷氨酰胺的高
效节能冻干工艺,不仅提高了样品的质量和效益,而
且节约了成本。这为氨酰谷氨酰胺生产节能降耗解
决了关键性问题。
3. 3 从热重结果分析预冻方式对丙氨酰谷氨酰胺
结晶度的影响
丙氨酰谷氨酰胺标准样品( 图3A) 、丙氨酰谷
氨酰胺快速预冻再冻干样品( 图3B) 和丙氨酰谷氨
酰胺退火预冻再冻干样品( 图3C) 的热重分析曲线
可反映不同丙氨酰谷氨酰胺样品在50 到800 ℃内
的质量变化情况。3 种样品在100 ℃附近均无明显
失重,说明标准样品及相关冻干样品中的水分含量
较低。
观察丙氨酰谷氨酰胺标准样品的热重测定曲
线,可看到丙氨酰谷氨酰胺标准样品有两个失重台
阶,用外推法求得两次失重的起始温度分别为
210. 35 和236. 35 ℃,直至800 ℃ 左右样品基本上
不再失重。*次失重后,样品剩余率为90. 92%,
第二次失重后,样品剩余率为28. 72%。此图说明
该样品在210. 35 ℃左右开始发生热分解。
然而,快速降温预冻再冻干的丙氨酰谷酰胺的
热重分析曲线( 图3B) 显示,样品从199. 62 到
236. 46 ℃和从236. 46 到800 ℃分别有两个失重过
程。*次失重后,样品剩余率为85. 31%,第二次
失重后,样品剩余率为28. 69%。其测定曲线与标
准样品曲线的差别较大。究其原因可能是由于采用
快速降温预冻再冻干易形成数目较多、颗粒细小的
药物晶体,从而在*次失重过程中,较多小颗粒
图3 丙氨酰谷氨酰胺的热重分析曲线
A - 标准样品; B - 快速降温预冻冻干样品; C - 多次变温退火预冻冻干样品
Fig. 3 TGA Curves of alanylglutamine samples
A - standard sample; B - freeze-dried sample following accelerated pre-freeze; C -
freeze-dried sample following multi-step annealing pre-freeze
且耐热性较差的药品晶体受热分解。
多次变温退火预冻后再冻干的丙氨酰谷氨酰胺
的热重分析曲线( 图3C) 显示,样品同样存在两个失
重台阶,分别为从212. 36 到235. 09 ℃和从235. 09
到800 ℃这两个失重过程。*次失重后,样品剩
余率为90. 30%,第二次失重后,样品剩余率为
27. 90%。该样品的失重起始温度和样品剩余率与
标准样品一致,说明退火冻干后药品的晶型和结构
未发生较大程度的改变,且药品具有较好结晶度和
热稳定性。
3. 4 从差示扫描量热结果分析预冻方式对丙氨酰
谷氨酰胺结晶度的影响
我们把丙氨酰谷氨酰胺标准样品作为参照,研
究分析了快速降温预冻和多次变温退火预冻方式对
丙氨酰谷氨酰胺样品热性质的影响。
丙氨酰谷酰胺标准样品的DSC 热分析曲线( 图
4A) 说明,丙氨酰谷氨酰胺标准样品在50 到250 ℃
内的受热变化过程。在该过程中,直到210 ℃,几乎
没有明显的变化。从210 ~ 230 ℃是一个丙氨酰谷
酰胺晶体的熔融和热分解过程( 图4) ,峰值温度在
221. 25 ℃。此熔融温度与《中国药典》2010 年版二
部附录ⅥC 表所记载丙氨酰谷酰胺熔点温度( 214 ~
218 ℃) 基本一致。这证明丙氨酰谷氨酰胺标准样
品结晶度和干燥度良好。
然而,快速降温预冻再冻干的丙氨酰谷酰胺
DSC 热分析曲线( 图4B) 显示,在152 ℃左右出现一
个非常明显的放热峰,可能对应了有少部分细小无
定形样品转化为晶型样品的相变过程,样品结构稳
定性增大,势能降低,因而放热; zui后218. 28 和
224. 12 ℃ 分别对应了两个叠加的熔融分解峰。
图4 氨酰谷氨酰胺的热分析曲线
A - 标准样品; B - 快速降温预冻冻干样品; C - 多次变温退火预冻冻干样品
Fig. 4 SC Curves of alanylglutamine samples
A - standard sample; B - freeze-dried sample following accelerated pre-freeze; C -
freeze-dried sample following multi-step annealing pre-freeze
中国药学杂志2016 年6 月第51 卷第11 期Chin Pharm J,2016 June,Vol. 51 No. 11 ·913·
218. 28 ℃熔融分解峰对应了结晶度不佳或晶粒细
碎样品的熔融分解; 224. 12 ℃熔融分解峰对应了结
晶度较好或晶粒较大样品的熔融分解。
其曲线与上述的参照标准样品曲线差别较大。
出现相变过程的原因有二: ①快速降温预冻冻干的
丙氨酰谷氨酰胺,其溶液经快速降温预冻后冻干,丙
氨酰谷氨酰胺药品的结晶过程迟于或与冰结晶过程
同时发生。冰晶的生长不仅阻止了丙氨酰谷氨酰胺
药品结晶前的传热和传质过程,而且不利于丙氨酰
谷氨酰胺晶体的生长,即冰晶的生长会抑制和损伤
样品的结晶,导致快速降温预冻后再冻干的丙氨酰
谷氨酰胺样品出现大量的碎晶、微晶和无定形体; ②
该过程预冻快,药物晶体的成核时间和生长时间均
太短,不利于其晶核生长,因此样品结晶度差,超细
无定形成分多。
多次变温退火预冻再冻干的丙氨酰谷氨酰胺
DSC 热分析曲线( 图4C) 显示,从50 到250 ℃内除
了222. 00 ℃的单一熔融分解峰外,既没有检出反玻
璃化转变过程,也没有检出样品无定形态到晶型的
相变过程。这证明该样品结晶度好,晶型单一,纯度
高。原因是逐步多次变温退火预冻后冻干的丙氨酰
谷氨酰胺样品其溶液在多次变温退火预冻过程中水
先成核、结晶和生长,丙氨酰谷氨酰胺药品得到高度
浓缩,冰和药液分离程度高[7]。当再次降温时,丙
氨酰谷氨酰胺药品的结晶生长几乎完全不受冰晶的
影响,避免了冰晶生长对药品结晶的损伤,提高样品
品质。因此,该方法制备的丙氨酰谷氨酰胺样品结
晶度和粒度均良好,纯度高。
3. 5 丙氨酰谷氨酰胺样品冻干工艺优化前后的效
果对比
多次变温退火预冻对冻干工艺的优化效果明
显。优化前,快速降温预冻再冻干整个冻干过程约
为73 h; 优化后,采用多次变温退火预冻,冻干过程
仅为约40 h,冻干时间缩短23 h。这样不仅节省了
能源,降低了成本,还提高了50% 的产量。在节能
方面,冻干工艺优化后,年均节能212. 76 万度,年均
碳排放量减少2 121. 22 吨。
4 结论
本实验用扫描电镜、X-射线粉末衍射、差示扫
描量热和热重分析,研究了快速降温预冻和多次
变温退火预冻两种不同的预冻方式对丙氨酰谷氨
酰胺溶液冻干样品结晶度和冻干工艺的影响。多
次变温退火预冻较快速降温预冻不仅有利于提高
丙氨酰谷氨酰胺的结晶度、粒度均一性和热稳定,
而且有利于减小冻干过程中水分的升华阻力,提
高传热传质效率,zui终提高冷冻干燥效率,从而起
到节能降耗的目的。可见,丙氨酰谷氨酰胺的预
冻方式的改变,不仅可以提高了样品的质量和效
益,还节约了成本,并为氨酰谷氨酰胺生产节能降
耗解决了关键性问题。
REFERENCES
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·914· Chin Pharm J,2016 June,Vol. 51 No. 11 中国药学杂志2016 年6 月第51 卷第11 期

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