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采用冷冻干燥工艺制备地区性凝血因子

时间:2017-12-04 点击次数:884

上海市临床检验中心于2014 年分别开展了凝血
因子的室间质评计划[2]。但所采用的室间调查
品均为进口商品质控品,由于价格昂贵、浓度水平
单一,无法满足室间质评的需要。我们采用冷冻
干燥技术处理新鲜血浆,制备凝血因子室间调查
品,并在上海地区开展凝血因子室间调查活动。
材料和方法
一、材料和仪器
所用试剂和仪器分别见表1 和表2。
表1 试剂使用表
试剂级别厂家或供应商
海藻糖分析纯SIGMA 公司
乳糖分析纯SIGMA 公司
聚乙二醇( PEG) 分析纯SIGMA 公司

( HEPES)
分析纯SIGMA 公司
甘氨酸分析纯SIGMA 公司
凝血酶原时间( PT) 试剂商品试剂SIMENES 公司
活化部分凝血活酶时间
( APTT) 试剂
商品试剂SIMENES 公司
纤维蛋白原试剂商品试剂SIMENES 公司
乏因子血浆Ⅷ 商品试剂SIMENES 公司
氯化钙( CaCL2
) 商品试剂SIMENES 公司
新鲜冰冻血浆采血时间为2013 年
1 月~ 10 月,有效期
1 年
上海市血液中心
长海医院输血科
表2 仪器使用表
名称型号厂家
电子天平BSA2245-CW,精度
d = 0. 1 mg
Sartorius 公司
三洋超低温冰箱SANYO Biomedcial
Freezer
真空冷冻干燥机Christ 1-4 LSC plus 德国Christ 公司
水平式离心机Allegra@ X-15R
Centrifuge
Beckman-Coulter 公司
水浴箱TW20 Julabo
全自动血凝仪CA-1500 Sysmex 公司
全自动血凝仪Evolution STAGO 公司
全自动血凝仪TOP IL 公司
全自动分装仪Dose-it 803
IBS INTEGRA
BIOSCIENCES
无菌超滤器7518-00 Masterflex 公司
二、方法
1. 血浆选择和处理献浆员经测试乙肝表面
抗原、丙肝抗体和人类免疫缺陷病毒-1 ( HIV-1)
抗体检测均阴性。制备的室间调查品凝血因子Ⅷ
包括低、中和高3 个浓度水平。凝血因子血浆的
制备方法: 抗凝剂为枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖和腺
嘌呤( CPD-A ) ,抗凝剂与血浆比例为
36 mL ∶ 200 mL,血液以1 200 × g 离心15 min,分
离上层液体至三联袋中得到血浆,在22 ℃条件下
以2 300 × g 离心10 min( 每单位血浆加入冻干保
护剂,然后以相同条件离心后待用,经检测凝血因
子浓度约为40% ~ 100%,可作为高浓度凝血因
子血浆[3]。( 1) 低浓度凝血因子血浆的制备方
法: 血浆中加入硫酸钡( BaSO4
) 与血浆比率为
1 ∶ 7( w /v) ( BaSO4
需经121 ℃高压灭菌15 min) ,
加入后在混匀器上混匀30 min。以2 300 × g 离
心10 min。取上清液,即为凝血因子含量低浓度
的血浆; ( 2) 中浓度凝血因子血浆的制备方法: 将
低浓度凝血因子血浆与未处理的原液按一定比例
稀释,可得到凝血因子Ⅷ浓度为7% ~ 50% 的各
浓度血浆。配制后的血浆浓度与预期浓度比较,
用回归方程统计,并用配对t 检验统计配制结果
是否符合预期) 。
2. 冻干保护剂配方为提高冻干制品的稳
定性,在冻干前需在血浆中加入一定配方的冻
干保护剂。( 1) 初筛实验: 实验采用HEPES、甘
氨酸、PEG、海藻糖按不同的配比分成10 个组
别,添加入血浆后在相同的真空压力下进行冷
冻干燥[4],测定PT 和APTT 结果,通过APTT、
PT、Fbg 变化情况、冻干品外观两个方面选择冻
干前、后样本测定值变化zui小,且冻干品外观zui
佳的保护剂[5]; ( 2) 冻干保护剂配方的优化: 采
用正交试验设计的方式[6],该设计是研究多因
素多水平的一种设计方法,根据正交性从全面
试验中挑选出部分有代表性的9 点进行试验,
通过这9 个点的检测结果,并按一定的统计分
析方法,以获取zui佳配比组合。
计算极差R 值,R 值为平均试验结果与
zui差平均试验结果的差值,反映此因素对于考察
指标的影响程度。差值zui大的因素为zui主要的因
素,依次类推,从而得到zui佳的海藻糖、甘氨酸和
HEPES 组合。
3. 血浆分装由于冻干品是采用冷冻干燥技
术将原有液态样本进行冷冻干燥处理使其成为固
态,使用时将冻干品中加入定量的液体,复溶成液
态样品。因此,对分装的样本量有精度要求。本
实验采用IBS 公司的Dose-it 803 分装仪对血浆进
行分装,并在分装的过程中抽取一定比例的样本
( 每5 支抽取1 支) ,共抽取10 支,用称重法得
到分装前、后样本的重量,两者重量相减即为
分装的样本量,计算后得到分装精度。评价方
·270· 检验医学2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,March 2015,Vol 30. No 3.
法采用样本加入量的平均值( s) 和变异系数
( CV% ) 。分装精度与欧洲凝血因子Ⅷ标准品
分装精度相比较[3]。
4. 样本冻干过程将在- 40 ℃低温冰箱中
预冻过夜的样本,快速放入Christ 冻干机按既定
程序完成冷冻干燥过程,具体步骤包括: 启动冻干
机,预冷至- 60 ℃放入制品,在此温度下进行升
华干燥,持续时间约为6 h; 提升隔板温度进行解
析干燥,持续时间为20 h。冻干完成后加盖放入
4 ℃保存。
5. 凝血因子冻干品性能评估对制备的室间
调查品的性能进行评估,其中均匀性和稳定性应
符合《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》
( CNAS-GL03) 要求[7]。此外,冻干品的含水量应
符合《中国药典》的要求[8]。
6. 组织初步调查将制备的冻干血浆调查品
发放至上海5 家临床实验室进行凝血因子活性的
实验室间评价。
结果
一、不同浓度凝血因子Ⅷ的配制效果
采用回归分析方法,将各浓度梯度调查品的
测定值与预期值进行比较,绘制预期值与实测值
的关系图( 图1) ,计算回归方程及r2 值分别为Y
= 0. 977 5X + 0. 747 8,r 2值为0. 995 2。凝血因子
Ⅷ%实测值与预期值作配对t 检验,结果差异无
统计学意义( P 值为0. 330,P > 0. 05) 。
注: Y = 0. 977 5X + 0. 747 8,r2 = 0. 995 2
图1 凝血因子Ⅷ的稀释梯度
二、冻干保护剂筛选试验
初筛试验和配方优化试验,结果见表3 ~ 6。
表3 冻干保护剂初筛表
组别初始A B C D E F G H I J
PT( s) 11. 0 14. 6 14. 6 13. 6 12. 5 12. 3 / / 17. 0 16. 5 16. 8
APTT( s) 27. 1 40. 9 41. 3 34. 2 29. 9 33. 8 / / 52. 6 49. 7 51. 7
Fbg( g /L) 2. 348 2. 538 2. 493 2. 381 2. 285 2. 381 / / 2. 348 2. 239 2. 415
蓬松度轻度萎缩轻度萎缩轻度萎缩较好较好结块结块很好很好轻度萎缩
冻干前、后13. 8 14. 2 7. 1 2. 8 6. 7 / / 25. 5 22. 6 24. 6
APTT 差值
表4 配方优化试验采用三水平、三因素的正交表L9( 33 ) 正交实验设计表( %)
浓度海藻糖( 因素1) 甘氨酸( 因素2) HEPES( 因素3)
浓度水平1 0. 5① 0. 10① 0. 10①
浓度水平2 1. 0② 0. 25② 0. 15②
浓度水平3 1. 5③ 0. 50③ 0. 20③
表5 正交实验设计方案及测定实际测定结果( %)
样本号序列
因素1
实际浓度
序列
因素2
实际浓度
序列
因素3
实际浓度( %)
冻干前FⅧ
实测值
冻干后FⅧ
实测值
1 ① 0. 5 ① 0. 10 ① 0. 10 76. 0 78. 0
2 ① 0. 5 ② 0. 25 ② 0. 15 72. 2 75. 0
3 ① 0. 5 ③ 0. 50 ③ 0. 20 70. 5 75. 7
4 ② 1. 0 ① 0. 10 ② 0. 15 69. 5 71. 0
5 ② 1. 0 ② 0. 25 ③ 0. 20 68. 9 69. 8
6 ② 1. 0 ③ 0. 50 ① 0. 10 69. 5 71. 0
7 ③ 1. 5 ① 0. 10 ③ 0. 20 68. 1 70. 7
8 ③ 1. 5 ② 0. 25 ① 0. 10 67. 8 72. 5
9 ③ 1. 5 ③ 0. 50 ② 0. 15 67. 8 70. 4
检验医学2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,March 2015,Vol 30. No 3. ·271·
表6 正交试验结果统计
样本号因素1 因素2 因素3 回收率%
1 1 1 1 102. 6
2 1 2 2 104. 0
3 1 3 3 107. 3
4 2 1 2 102. 2
5 2 2 3 101. 3
6 2 3 1 102. 2
7 3 1 3 103. 9
7 3 1 3 103. 9
8 3 2 1 106. 9
9 3 3 2 103. 8
K1 313. 9 308. 8 311. 7
K2 305. 8 312. 1 312. 1
K3 314. 6 313. 4 312. 5
k1 104. 6 102. 9 103. 9
k2 101. 9 104. 0 104. 0
k3 104. 9 104. 5 104. 2
R 值2. 94 1. 54 0. 26
其中,A 组为2. 5 mg /mL 氨基酸; B 组为
5 mg /mL 甘氨酸; C 组为10 mg /mL 甘氨酸; D 组
为5 mg /mL HEPES; E 组为10 mg /mL HEPES;
F 组为2. 5 mg /mL PEG; G 组为2. 5 mg /mL PEG;
H 组为2. 5 mg /mL 海藻糖; I 组为2. 5 mg /mL 海
藻糖; J 组为未加保护剂。
按原定方案选择冻干前、后差异较小,冻干外
观较佳的为B、D、E、H 组成分作为冻干保护剂的
主要成分。
K1 为每列中所有“1”序列之和,K2 为每列中
所有“2”序列之和,K3 为每列中所有“3”序列之
和; k1 = K1 /3,k2 = K2 /3,k3 = K3 /3; R 值为极差
值,为每列中zui大值与zui小值的插值,R 值zui大为
因素1,R 值zui小为因素3,因素1 > 因素2 > 因素
3。据此得出,海藻糖为主要因素,对每个因素的
k3 zui大,所以zui佳配方是海藻糖( 1. 5%) 、甘氨酸
( 0. 5%) 和HEPES( 0. 2%) 。血浆中加入此配方
的保护剂,冻干后凝血Ⅷ% 的回收率能达到
100%左右。
三、分装精度的评价
结果见表7。统计得到分装精度为每瓶的平
均分装值为0. 569 9 g( 扣除试管本身重量) ,范围
为0. 564 6 ~ 0. 576 7 g,s 为0. 003 5 g,CV 为
0. 61%,与欧洲凝血因子Ⅷ标准品分装精度CV
为0. 61%相一致。
四、调查品评估
1. 均匀性和稳定性用同质性检验证明样本
一致性程度,由于凝血因子Ⅷ%一期法检测是基于
APTT 实验的,所获得的凝血因子Ⅷ%测定值为通
过定标曲线折算后的结果,所以同质性检验以
APTT 秒数为基准。以冻干前、后APTT 测定值( 秒
数) 的平均数计算均匀性和稳定性结果,见表8。
表7 冻干样本的分装精度
数值
空瓶重量
( g)
加样0. 5 mL 血浆后
瓶重( g)
加入血浆量
( g)
冻干后瓶重
( g)
冻干品重量
( g)
冻干前、后差值
平均值5. 963 8 6. 533 7 0. 569 9 6. 007 2 0. 043 4 0. 526 5
标准差0. 020 0 0. 021 9 0. 003 5 0. 021 5 0. 002 5 0. 002 0
CV% 0. 334 6 0. 334 6 0. 613 2 0. 357 1 5. 670 4
表8 均匀性和稳定性结果
评价项目
APTT( s)
均匀性
单因素ANOVA
稳定性
T 检验|珋x - 珋y |≤0. 3σ
0. 06 P = 0. 053 0. 07
界值F 界值= 3. 02 α = 0. 05 水平1. 702
结论F = 0. 06 < 3. 02 均匀性符合要求P = 0. 053 > 0. 05 两组均值差异
无统计学意义
|珋x - 珋y | = 0. 07 < 1. 702 稳定性符
合要求
2. 样本含水量应用Karl Fischer 滴定分析
法测定冻干样本的含水量。按《中国药典》规定,
凝血因子Ⅷ冻干品的含水量应小于3%,我们自
制冻干品平均含水量为1. 22%,s 为0. 197%,CV
为16%,符合要求。
五、实验室室间调查
采用自制质控品水平1、水平2、水平3,结果
见表9。
·272· 检验医学2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,March 2015,Vol 30. No 3.
表9 各医院凝血因子Ⅷ%的检测结果
医院仪器品牌水平1 水平2 水平3
RJ1 ACL-TOP 7. 1 43. 3 73. 0
RJ2 CA-7000 6. 4 50. 3 78. 5
HS CA-7000 7. 7 52. 5 100. 0
PT CA-1500 10. 6 66. 7 130. 0
SCCL CA-1500 7. 0 49. 2 78. 1
均值7. 8 52. 4 91. 9
s 1. 7 8. 7 23. 7
CV( %) 21. 3 16. 6 25. 8
讨论
上海地区目前多家三级医院开展凝血因子检
测项目。上海市临床检验中心对凝血项目的开展
情况进行了一次调查,发现凝血项目检测( 包括
凝血因子) 普遍存在的问题: ( 1) 试剂批号更换频
繁: 检测人员无法独立完成定标操作,主要依靠厂
商的技术员。每次检测前未进行定标操作; ( 2)
定标方法错误: 未采用实测法获得定标曲线; ( 3)
实验室未参加室间质评计划,无法评价不同实验
室检测结果之间的一致性。为此,开展凝血因子
室间调查非常有必要。
通过我们的研究表明,凝血因子的均匀性和
稳定性符合《能力验证样品均匀性和稳定性评价
指南》的要求,室间调查结果显示,自制凝血因子
冻干品和商品化的质控品在所调查的5 家医院实
验室结果间CV% 分别为: 水平1( 21. 3%) ,水平
2( 16. 6%) ,水平3( 25. 8%) ,与卫生部临床检验
中心的调查结果( CV 约20%) 比较接近,所以自
制凝血因子调查品的测定结果也部分反映实验室
的实际检测水平。
凝血因子检测项目的逐步开展,凝血因子检
测的规范化也随之完善,世界血友病联盟( WFH)
也对凝血因子的实验室检测提出规范化要求。在
上海,开展凝血因子检测项目的实验室远低于国
外的实验室,凝血因子的检测方法绝大多数实验
室仍然局限于一期法。使用高敏试剂的实验室数
量极少。每批凝血因子项目检测进行重新定标的
实验室也很少。这种情况与国外实验室的因子检
测水平相比存在较大差距。2002 年已经颁布
WS /T 220-2002《中华人民共和国卫生行业标准
凝血因子活性测定总则》。
此次制备的凝血因子调查品缺乏溯源性,调
查没有采用经赋值的冻干品。对于某个室间调查
项目,参加实验室少于10 家的情况下,由于所采
用的检测系统不同,无法将所有实验室的检测结
果相加求平均值,造成所有检测结果未达到统计
学zui少例数,降低了统计结果的可靠性。这种情
况下可由两种解决方法: ( 1) 采用经赋值的冻干
调查品进行室间调查,即将已赋值的调查品发放
至各实验室进行室间调查,将回馈结果与赋值结
果相比较,得到反馈报告; ( 2) 增加调查实验室的
个数,达到统计学要求。
不同国家和地区相继建立自身的凝血因子检
测的标准品体系。中检院虽然凝血因子Ⅷ标准品
出售,但价格昂贵,缺乏临床使用价值。临床上使
用zui多的还是商品化的标准血浆,由于每个系统
所用标准血浆不同,检测结果的可比性存在一定
差异。文献表明凝血因子检测的zui主要的影响因
素是标准品存在差异。此外,上海市临床检验中
心的主要职能就是帮助各医院实验室操作者掌握
标准的操作规范,为此我们实验室应该为需要的
实验室提供。并且作为世界卫生组织
( WHO) 试剂合作中心,我们应加强与WHO 在
Shefield 的凝血总部合作,研制出一种可以溯源至
国内甚至国际标准品的比对物质,然后将冻干品
发放给各医院的实验室,与临床样本同步检测,这
样可以提高检测的可靠性。同时也为临床实验室
节约成本支出。
参考文

 

 

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