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冻干工艺及保护剂对羟基喜树碱脂质体质量的影响

时间:2017-12-04 点击次数:1348

摘要:用薄膜水化- 高压均质法制备羟基喜树碱脂质体,以葡聚糖凝胶色谱法分离脂质体和游离药物,采用HPLC 法测定包
封率。通过差示扫描量热法测定含不同保护剂的脂质体的zui低共熔点和玻璃化转变温度,并比较冻干品外观、冻干前后脂质
体包封率和粒径的变化,优选出zui佳的冻干工艺、冻干保护剂种类及比例。结果表明,以6%蔗糖为冻干保护剂,经4 ℃、1 h,
-18 ℃、12 h 和-35 ℃、5 h 逐步预冻,然后于-54 ℃冷冻干燥24 h,制得的冻干品外观良好,脂质体复溶后粒径变化小,包
封率达(87.0±2.7)%。
关键词:羟基喜树碱;脂质体;冻干工艺;冻干保护剂
中图分类号:R944.9 文献标志码:A 文章编号:1001-8255(2012)01-0030-05

羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecine,1) 是
喜树碱类的衍生物,属于拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,广
泛用于治疗原发性肝癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌等,
疗效明显,不良反应较少。由于1 不溶于水,易溶
于稀碱溶液,主要通过氢氧化钠碱化开环制成钠盐
注射液、粉针剂应用于临床,虽增加了水溶性,但
破坏了1 的六元α- 羟基内酯环的完整性,抗肿瘤
效果显著降低[1,2]。
采用脂质体技术包裹1,可改善1 的溶解性并
保护1 的内酯环结构,但脂质体在水性环境中易发
生粒子聚集、沉降、融合、磷脂的氧化和水解、药
物渗漏等稳定性问题。因此,为提高脂质体的贮存
稳定性,将其制成冻干制剂以降低磷脂的水解和氧
化速度,延长贮存时间。冻干工艺及冻干保护剂种
类对脂质体的质量有重要影响,因此本研究以外观、

包封率和粒径为指标,考察二者对1 脂质体冻干效
果和复溶后性质的影响,优化1 脂质体的冻干保护
剂及冻干工艺,为其工业生产提供参考。
1 仪器和试药
1100 型液相色谱仪、G1314A 型紫外检测器( 美
国Agilent 公司) ;Zetasizer Nano ZS90 型纳米粒度分析仪
( 英国Malvern 公司) ;DSC-204 型差示扫描量热仪( 德国
Netzsch 公司) ;EmulsiFlex-C3 型纳米高压均质机( 加拿大
Avestin 公司) ;ALPHA 1-4 LD plus 型冷冻干燥机( 德国
Christ 公司)。
1 原药( 成都天源天然产物有限公司,含量98.3 %,
批号080701) ;大豆磷脂S100( 德国Lipoid 公司) ;1 对照
品( 中国食品药品检定研究院,批号200301) ;Sephadex
G-75(Amersham Biosciences 公司) ;胆固醇( 分析纯,广州
天马精细化工厂) ;乳糖( 药用级,荷兰DMV 有限公
司) ;甘露醇( 注射级,广西南宁化学制药有限责任公司) ;
葡萄糖( 分析纯,天津市大茂化学试剂厂);蔗糖( 药用级,
湖南尔康制药有限公司) ;麦芽糖( 注射级,日本食品化工
株式会社) ;山梨醇( 注射级,中国医药集团上海化学试剂
公司) ;甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 1 脂质体冻干品的制备
采用薄膜水化- 高压均质方法。取1 400 mg、
大豆磷脂4 g 与胆固醇500 mg 置茄形瓶中,加无
水乙醇- 二氯甲烷( 1 ∶ 2) 混合液使溶解,40 ℃
旋转蒸发至成膜,减压干燥过夜。加磷酸盐缓冲液
(PBS,pH 6.0) 室温水化,所得乳白色的混悬液经
高压均质机均化(均化压力为15 000 psi),循环4次,
加入冻干保护剂,经0.45 μm 微孔滤膜过滤,滤液
分装于西林瓶中,然后经4 ℃ (1 h)、-18 ℃ (12 h)
和-35 ℃ (5 h) 分步预冻后,置冷阱温度为-54 ℃、
真空度为0.34 mbar 的冷冻干燥机中,冷冻干燥24 h,
即得1 脂质体冻干品。同法制备不含1 的空白脂质
体混悬液。
2.2 1 脂质体冻干前后粒径的测定
取1 脂质体混悬液,以水为分散介质稀释至适
当倍数( 冻干品则加水复溶并稀释),测定粒径。
2.3 1 脂质体冻干品复溶时间的测定
取1 脂质体冻干品,加水复溶,记录块状物溶
解并形成脂质体混悬液的时间。
2.4 1 脂质体包封率的测定
2.4.1 色谱条件及凝胶色谱条件
采用HPLC 法测定1 的含量[ 3]。色谱条件:
色谱柱 Kromasil C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);
流动相 甲醇- pH 6.5 PBS(50 ∶ 50) ;检测波长
266 nm ;流速 1.0 ml/ min ;柱温 35 ℃ ;进样量
20 μl。
利用1 不溶于水而易溶于0.1 mol/L 氢氧化钠
溶液的特性,采用Sephadex G-75 凝胶色谱法分离
脂质体与游离1。采用梯度洗脱:先用pH 6.0 PBS
将载药脂质体完全洗脱,然后用0.1 mol/L 氢氧化
钠溶液(pH 12.0) 洗脱,截留在柱子顶端的1 溶
解成一黄色环带,并逐步被洗脱。洗脱曲线见图
1。结果表明用pH 6.0 PBS 15 ml 洗脱后脂质体已
完全被洗出,游离药物和脂质体能达到较好分离。
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 10 20 30 40 50 60 70
- 载药脂质体; ◆- 游离1
洗脱体积/ml
图1 载药脂质体及游离1 洗脱曲线图
2.4.2 包封率的测定
取1 脂质体混悬液100 μl,上SephadexG-75
凝胶柱,用pH 6.0 PBS 洗脱,收集前15 ml,置
25 ml 量瓶中,加入甲醇8 ml 超声破乳后定容,取
样测定,得包封在脂质体中的药量。另取1 脂质体
混悬液100 μl 置25 ml 量瓶中,加入甲醇20 ml 超
声破乳后定容,取样测定得总药量。计算1 脂质体
包封率。
精密称取1 对照品10 mg 置100 ml 量瓶中,
用甲醇溶解并定容,精密量取2 ml 置50 ml 量瓶,
用流动相定容得4 μg/ml 的1 对照品溶液。分别取
空白脂质体和1 脂质体混悬液100 μl 置25 ml 量

瓶中,加入甲醇20 ml 超声破乳后定容,即得空白
脂质体样品溶液和1 脂质体样品溶液。取上述3 种
溶液分别进样测定,典型色谱图见图2。以峰面积
A 对1 浓度c 进样线性回归,得标准曲线方程为
A=8 572.60c-918.77,r=0.999 5,线性范围为0.04 ~
30 μg/ml ;平均回收率为(101.50±1.62)% (n=9) ;凝
胶柱色谱法分离游离1 的回收率为(99.15±1.60)%
(n=9) ;1 脂质体的回收率为(102.80±1.10)% (n=9),
表明使用HPLC 法测定1 的含量准确度好,用凝胶
色谱柱方法分离脂质体和游离药物的分离度高,准
确度好。
A B
A :1对照品溶液( ml ),B:1脂质体样品溶液(3 ml)
1-1
mAU
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
t/min
1
mAU
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
t/min
1
图2 典型色谱图
2.5 冻干工艺的考察
2.5.1 zui低共熔点和玻璃化转变温度的测定
预冻温度应低于药液的zui低共熔点,否则样
品冻结不实,在减压升华时会膨胀起泡或药液喷
瓶。在冻干过程中,控制温度低于样品的玻璃化
转变温度,可得到结构疏松、表面美观、复溶后
粒径变化小的冻干脂质体[ 4]。本研究利用差示扫
描量热(DSC) 法测定了选用不同冻干保护剂( 蔗
糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇)
制备的1 脂质体的zui低共熔点和玻璃化转变温度,
结果见表1。
预试验分别考察了-18 ℃和-80 ℃预冻12 h 后
再进行冷冻干燥的效果,结果表明经-18 ℃预冻
后,样品在冻干过程中的“沸腾”现象严重,冻
干产品表面凹凸不平甚至鼓泡。而采用-80 ℃预
冻得到的冻干品表面呈光滑的玻璃状,复溶后为
类白色混悬液,但有药物结晶析出,提示制品的
包封率已严重下降,原因可能是直接采用-80 ℃
表1 含不同冻干保护剂的脂质体zui低共熔点与玻璃
化转变温度,n=3)
种类zui低共熔点/℃ 玻璃化转变温度/℃
甘露醇-13.8±0.2 -49.8±0.1
麦芽糖-21.3±0.1 -41.5±0.2
乳糖-22.6±0.2 -39.8±0.1
山梨醇-23.7±0.2 -51.1±0.1
葡萄糖-25.2±0.1 -50.1±0.3
蔗糖-28.7±0.1 -45.5±0.2
预冻,制品的降温速率太快,在快速冷冻时,冰晶
从瓶底向上生长形成枝状冰晶,溶质在冷冻过程中
迁移到顶部,导致无定形溶质在冻干品顶部形成近
乎封闭的一层[5]。根据上述测定结果及预试验结果,
选择预冻温度为-35 ℃,冻干温度为-54 ℃。
2.5.2 预冻速度的考察
预冻速度即降温速度,是冷冻过程中的一个
重要参数,对产品的质量影响较大[ 6,7]。本研究参
考文献[ 8] 并略加改进,将加入蔗糖作为冻干保护
剂的样品进行慢冻( 即分步预冻:4 ℃放置1 h,
-18 ℃预冻12 h,-35 ℃预冻5 h) 或速冻( 直接
-35 ℃预冻12 h) 后再于-54 ℃冻干24 h,考察预
冻速度对产品质量的影响。结果表明,两种方式
得到的冻干品外观均为类白色疏松块状物,但复
溶后溶液的状态差别显著。采用速冻方式的冻干
品,复溶后可见淡黄色的颗粒沉淀,慢冻的产品
复溶后外观为均匀的类白色混悬液。主要原因可
能是速冻过程会形成较多尺寸较小的细晶,造成
脂质体膜的损伤,使部分1 在冻干品复溶后析出。
而慢冻过程易形成大颗粒的冰晶,减少冰晶嵌入
脂质体双层膜致其受损的几率。因此,选择慢冻
方式即分步预冻。
2.5.3 冻干保护剂的加入方式
冻干保护剂在脂质膜的内水相和外水相平衡,
才能对脂质体起到保护的作用。如保护剂只存在
于膜内或膜外,则无法起到足够的保护作用[ 9,10]。
本研究比较了内加法( 在脂质体制备过程中将保
护剂加至水相介质中) 和外加法( 制备好脂质体
混悬液后再加入保护剂) 对冻干产品的影响。

表2 冻干保护剂加入方式对冻干脂质体的
影响1) ,n=3)
方法
冻干前
粒径/nm
冻干后
复溶粒径/nm
冻干前
包封率/%
冻干后
包封率 /%
内加法192±2.6 195±3.3 82.7±2.3 81.4±1.9
外加法198±1.8 196±2.2 83.2±3.4 82.8±2.5
注:1) 两种方式得到的冻干品外观均为类白色疏松块状物
结果表明,保护剂的加入方式对产品的外观及
包封率影响不大,两者没有显著差异。
结果表明,以蔗糖和麦芽糖作为1 脂质体的冻
干保护剂,冻干前后的粒径和包封率均无明显变化,
冻干品外观良好。但目前国内注射级麦芽糖须从日
本进口,价格昂贵。因此,选择以蔗糖为1 脂质体
的冻干保护剂,并进一步考察zui佳的保护比例。
2.5.5 不同浓度蔗糖对脂质体的保护作用
考察了蔗糖浓度分别为1%、2%、4%、6%、
8%和10%时对脂质体的保护作用,以确定zui优的
保护比例。结果见表4。
表4 不同浓度蔗糖对1 脂质体的保护作用1)
,n=3)
蔗糖浓度/% 粒径/nm 包封率/%
冻干前冻干后冻干前冻干后
1 192±4.6 958±2.3 85.8±1.5 7.0±0.3
2 208±1.8 224±1.2 87.5±1.6 63.2±2.7
4 191±2.2 197±4.4 86.5±2.3 84.6±1.9
6 197±3.7 186±3.6 87.3±2.3 87.0±2.7
8 193±4.5 188±2.5 87.6±1.9 83.4±1.4
10 191±3.4 180±3.1 86.3±1.8 81.1±1.0
注:1) 所得脂质体冻干后均为类白色疏松块状物
由表4 可见,蔗糖浓度达到6%时保护作用zui
2.5.4 不同冻干保护剂对脂质体的保护作用
按“2.1”项下方法制备不含冻干保护剂的1
脂质体,然后采用外加法加入各冻干保护剂后冻
干。以脂质体冻干后的外观、复溶时间、粒径和
包封率为评价指标,筛选冻干保护剂种类。考察
了6 种常用的冻干保护剂:山梨醇、蔗糖、甘露
醇、乳糖、葡萄糖和麦芽糖[ 7],浓度均为10 %。
结果见表3。
表3 不同冻干保护剂对1 脂质体的保护作用,n=3)
保护剂复溶时间/s 粒径/nm 包封率/% 冻干后外观
冻干前冻干后冻干前冻干后
无20±1.3 199±1.9 1 060±3.2 87.2±2.0 2.7±0.1 类白色萎缩物
甘露醇82±4.2 194±4.0 1 420±2.9 86.7±2.3 6.0±0.2 类白色块状物
麦芽糖6±1.5 203±1.9 203±1.7 87.5±1.8 80.5±3.4 类白色块状物
乳糖11±3.1 186±2.1 154±1.9 86.8±1.5 47.8±2.3 类白色块状物
山梨醇254±2.8 202±3.6 240±2.5 85.7±2.0 20.7±0.9 类白色带鼓泡块状物
葡萄糖18±0.9 196±4.9 196±2.4 88.1±1.6 53.4±1.9 类白色萎缩物
蔗糖17±1.7 194±5.7 165±2.0 87.6±2.4 83.1±2.3 类白色块状物
佳。这是由于在降温速率一定的情况下,增大保护
剂浓度能较大程度地实现溶液的部分玻璃化,减少
冰晶对脂质体膜的损伤。但当超过6%后,反而造
成脂质体包封率的下降,可能是蔗糖浓度过大时破
坏了脂质体膜内外的压力平衡,对脂质体膜产生一
定的破坏作用,导致脂质体破裂。
3  讨论
3.1 脂质体的冷冻干燥应考虑预冻的温度和预冻的
速率,预冻的温度在zui低共熔点以下5 ~ 20 ℃为
宜,且应避免快速冷冻。本研究在考察了含不同保
护剂脂质体的zui低共熔点的基础上,采用4 ℃放置
1 h,-18 ℃预冻12 h,-35 ℃预冻5 h 的分步预冻
方式,降低了预冻时的降温速率,对脂质体膜起到
保护作用。
3.2 冻干保护剂的加入可降低冻结过程中脂质体囊
泡的脱水速度和皱缩程度,并防止冰晶对囊泡的机
械损伤,同时可提高脂质体混悬液的玻璃化转变温
度。在本研究中,不加冻干保护剂,冻干品萎缩,复
溶后,粒径显著增大,包封率显著下降。而加入冻
干保护剂后,对脂质体的包封率具有保护作用,在
常用的保护剂中,甘露醇的保护作用zui差,这是因
· 3 4 · 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2012, 43(1)
为甘露醇作为脂质体保护剂具有反玻璃化现象[11]。
在测定各冻干保护剂的玻璃化转变温度时,可见甘
露醇在玻璃化转变后有一个明显的放热峰,此现象
提示反玻璃化是甘露醇对脂质体的冻干保护效果较
差的主要原因。
3.3 以脂质体冻干品的外观、复溶时间、粒径和包
封率为指标,探索了1 脂质体的冻干工艺。结果
表明,以慢速在较低温度下预冻,并采用6%的蔗
糖为冻干保护剂,冷冻干燥24 h,能制得外观为类
白色疏松块状物的冻干品,该制品易复溶,分散
性好,冻干前后包封率均高于85%,平均粒径约
200 nm,有利于被动靶向于肝、脾等器官。本研究
为工业生产脂质体冻干品提供了参考,但由于设备
条件所限,冷冻的降温速率及冻干曲线有待进一步
探索。
参考文献:
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